Cours:La chromatographie sur couche mince "CCM"

Définition et appareillage:
La chromatographie sur couche mince (CCM) repose principalement sur des phénomènes
d'adsorption : la phase mobile est un solvant ou un mélange de solvants, qui progresse le
long d'une phase stationnaire fixée sur une plaque de verre ou sur une feuille semi-rigide
de matière plastique ou d'aluminium. Après que l'échantillon ait été déposé sur la phase
stationnaire, les substances migrent à une vitesse qui dépend de leur nature et de celle du
solvant.
Les principaux éléments d'une séparation chromatographique sur couche
mince sont:
• la cuve chromatographique : un récipient habituellement en verre, de forme variable,
fermé par un couvercle étanche.
• la phase stationnaire : une couche d'environ 0,25 mm de gel de silice ou d'un autre
adsorbant est fixée sur une plaque de verre à l'aide d'un liant comme le sulfate de
calcium hydraté (plâtre de Paris) l'amidon ou un polymère organique.
• l'échantillon : environ un microlitre (μl) de solution diluée ( 2 à 5 %) du mélange à
analyser, déposé en un point repère situé au-dessus de la surface de l'éluant.
• l'éluant : un solvant pur ou un mélange : il migre lentement le long de la plaque en
entraînant les composants de l'échantillon.
Principe de la technique.
Lorsque la plaque sur laquelle on a déposé l'échantillon est placée dans la cuve, l'éluant
monte à travers la phase stationnaire, essentiellement par capillarité. En outre, chaque
composant de l'échantillon se déplace à sa propre vitesse derrière le front du solvant.
Cette vitesse dépend d'une part, des forces électrostatiques retenant le composant sur la
plaque stationnaire et, d'autre part, de sa solubilité dans la phase mobile. Les composés se déplacent donc alternativement de la phase stationnaire à la phase mobile, l'action de
rétention de la phase stationnaire étant principalement contrôlée par des phénomènes
d'adsorption. Généralement, en chromatographie sur couche mince, les substances de
faible polarité migrent plus rapidement que les composants polaires.
Applications de la CCM.
Lorsque les conditions opératoires sont connues, elle permet un contrôle aisé et rapide de
la pureté d'un composé organique. Si l'analyse, réalisée avec divers solvants et différents
adsorbants, révèle la présence d'une seule substance, on peut alors considérer que cet
échantillon est probablement pur.
De plus, étant donné que la chromatographie sur couche mince indique le nombre de
composants d'un mélange, on peut l'employer pour suivre la progression d'une réaction.
La chromatographie sur couche mince est également la technique habituellement
employée pour rechercher le meilleur solvant, avant d'entreprendre une séparation par
chromatographie sur colonne.
Adsorbants et plaques chromatographiques.
Par ordre d'importance décroissante, les adsorbants employés en CCM sont : le gel de
silice, l'alumine, le kieselguhr et la cellulose.
Les plaques vous seront fournies prêtes à l'emploi.
Choix de l'éluant.
L'éluant est formé d'un solvant unique ou d'un mélange de solvants.
Un éluant qui entraîne tous les composants de l'échantillon est trop polaire; celui qui
empêche leur migration ne l'est pas suffisamment.
Une méthode simple pour trouver l'éluant approprié consiste à préparer des solutions de
l'échantillon dans différents solvants, en concentration d'environ 2 à 5% en volume. A
l'aide d'une micropipette, on dépose une goutte de chaque solution sur une plaque,
chacune séparée d'environ 1 cm. Le meilleur éluant est celui qui, lorsqu'il a terminé sa
migration, a entraîné le soluté à une distance d'environ la moitié de celle qu'il a
parcourue.
Une autre méthode consiste à déposer une solution des substances à analyser en plusieurs
points, séparés d'environ 2 cm. Après séchage, on applique au centre de chaque point une micropipette remplie de solvant; Après diffusion, l'éluant qui convient sépare les solutés.

Choix de l'éluant dans le cas d'analyses :
• d'hydrocarbures : hexane, éther de pétrole ou benzène.
• de groupements fonctionnels courants : hexane ou éther de pétrole mélangés en
proportions variables avec du benzène ou de l'éther diéthylique forment un éluant de
polarité moyenne.
• de composés polaires : éthanoate d'éthyle, propanone ou méthanol.
Dépôt de l'échantillon.
L'échantillon est mis en solution (2 à 5 %) dans un solvant volatil, qui n'est pas
forcément le même que l'éluant : on emploie fréquemment le trichlorométhane
(chloroforme),la propanone ou le dichlorométhane.La solution est déposée en un point de
la plaque situé à environ 1 cm de la partie inférieure.
Il est important que le diamètre de la tache produite au moment du dépôt soit faible;
idéalement, il ne devrait pas dépasser 3 mm. Ce sont généralement les dépôts les moins
étalés qui permettent les meilleures séparations. Pour augmenter la quantité déposée, il
est toujours préférable d'effectuer plusieurs dépôts au même point, en séchant
rapidement entre chaque application plutôt que de déposer en une seule fois un grand
volume d'échantillon qui produirait une tache plus large.
L'échantillon est déposé à l'aide d'une micropipette ou d'un tube capillaire en appuyant
légèrement et brièvement l'extrémité de la pipette sur la couche d'adsorbant en prenant
soin de ne pas le détériorer. On peut aussi utiliser l'extrêmité, un peu émoussée, d'un
cure-dent.
On vérifie l'identité des composants présumés d'un échantillon, en procédant à un dépôt
séparé d'une solution de chacun d'eux puis à celui de leur mélange. Ces solutions témoins
permettent de comparer la migration de chaque composé avec celle de l'échantillon à
analyser.
2.7.Développement de la plaque.
Le développement consiste à faire migrer le solvant sur la plaque. Dans les analyses
usuelles de laboratoire, le principal type de développement est la chromatographie.
ascendante : la plaque est placée en position verticale dans une cuve et le solvant qui en
recouvre le fond monte par capillarité.
Le niveau de liquide est ajusté à environ 0,5 cm du fond de la cuve; on place souvent du
papier filtre contre les parois de la cuve pour saturer plus rapidement la cuve en vapeurs
d'éluant et éviter les effets de bords.Pendant le développement du chromatogramme, la
cuve doit demeurer fermée et ne pas être déplacée.
Lorsque la position du front du solvant arrive à environ 1 cm de l'extrémité supérieure, la
plaque est retirée de la cuve, le niveau atteint par le solvant est marqué par un trait fin,
puis la plaque est séchée à l'air libre ou à l'aide d'un séchoir.
.Révélation.
L'identification des substances isolées se fait selon différentes méthodes (valable
également pour la chromatographie sur papier):
• directement si les substances sont colorées
• à l'aide de révélateurs si elles sont incolores afin de les transformer en taches
colorées; les produits sont souvent décelés par leurs réactions fonctionnelles
classiques: les acides aminés par la ninhydrine qui donne avec la plupart une couleur
bleu-violet, les acides organiques par des indicateurs colorés, les sucres par le
réactifde Molisch qui utilise le pouvoir réducteur des sucres. Quelques réactifs
comme l'iode ou le permanganate donnent des colorations non spécifiques avec la
plupart des composés organiques.
• toutes les ubstances ayant une absorption dans la région au-dessus de 230 nm sont
étudiées sur des supports additionnnés de corps fluorescents par irradiation de
lumière UV à ondes courtes (λmax< 254 nm). L'emploi de couches non additionnées
de produits fluorescents permet aussi la mise en évidence de beaucoup de substances
dans l'UV à ondes courtes (λmax <254 nm) ou à ondes lon,gues (λmax > 366 nm) par
suite de la fluorescence propre des composés.
Dans tous les cas, il faut noter les positions des taches colorées juste à la fin de la
chromatographie en les cerclant car certains produits disparaissent avec le temps.